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n°10 - novembre 92


PCR VIH-1 in situ : une autre méthode de quantification de la charge virale ?

Christine Defer
Laboratoire d'immunologie des maladies virales Centre régional de transfusion sanguine (Lille)
Michèle Maniez
Laboratoire d'immunologie des maladies virales Centre régional de transfusion sanguine (Lille)






Detection of human immunodeficiency virus type 1 in mononuclear cells by in situ polymerase chain reaction
Bagasra O., Hauptman S.P., Lischner H.W., Sachs M., Pomerantz R.J.
The New England Journal of Medicine, 326, 21, 1385-1391

La technique de PCR in situ employée pour déterminer la charge virale peut aider à évaluer l'évolution de l'infection et l'efficacité d'une thérapeutique; sa plus grande sensibilité peut, en outre, aider dans la détermination du diagnostic d'infection des enfants nés de mères séropositives.

Depuis que le VIH a été décrit comme étant l'agent étiologique du sida, de nombreuses études ont tenté de quantifier la charge virale et d'établir une corrélation avec la pathogénèse et le statut clinique de la maladie.

Bagasra et coll. ont développé la technique de PCR in situ afin de déterminer le nombre précis de cellules mononucléées du sang périphérique infectées par le VIH-1, qu'il soit à l'état latent ou productif, chez des patients séropositifs à des stades différents de la maladie.

Une cellule intacte peut être considérée comme une « enceinte » d'amplification. Pour cela, il suffit, après fixation des cellules sur lame, de les rendre perméables par le formaldéhyde. Les réactifs de la PCR incluant la Taq polymerase et les amorces (gag SK38-39) peuvent ensuite diffuser dans la cellule. Après l'étape d'amplification, les produits obtenus sont détectés après un oligonucléotide biotinylé (sonde SK19) selon une méthode classique d'hybridation in situ. Un total de 10 000 cellules est compté au microscope afin de calculer précisément le pourcentage de cellules infectées (coloration rouge brun). Après amplification, la majorité du produit amplifié se situe à l'intérieur du noyau.

Les cellules de 56 patients adultes séropositifs ont été analysées: le taux de cellules infectées varie de 0,1 à 3,6 % (moyenne de 0,9 %) chez 19 patients asymptomatiques (stade II) et de 1,2 à 13,5 % (moyenne de 6,6 %) chez 13 patients infectés présentant une lymphadénopathie généralisée persistante (stade III), de 0,1 à 11,8 % (moyenne de 4,6 %) chez 19 patients en phase sida (stade IV-A à IV-C, p < 0,001). A noter qu'aucune différence significative n'est observée entre les patients au stade III et ceux au stade IV-A à IV-C. Le taux est relativement plus faible - 0,8 à 2 % (moyenne de 1,6 %) - chez 5 patients en phase sida au stade IV-D (avec un sarcome de Kaposi, sans infection opportuniste).

Cette étude est la première couplant une réaction de PCR ADN à une technique d'hybridation in situ standard ; jusqu'ici, les travaux publiés comportaient l'une ou l'autre de ces méthodes.

Avec l'hybridation in situ seule, les auteurs disent obtenir 1 pour 5 000 à 1 pour 100 000 cellules infectées. Ces résultats sont confirmés par d'autres études d'hybridation in situ spécifique de l'ARN du VIH (1 pour 10 000 à 1 pour 100 000 cellules est infectée). Ce faible nombre de cellules infectées est probablement dû au fait que cette technique ne permet pas de détecter le VIH s'il se trouve sous forme latente provirale sans expression des ARN messagers viraux.

Une autre approche de la quantification ou de la semi-quantification a pu être réalisée par la PCR, technique très sensible. Chez les sujets séropositifs asymptomatiques, le nombre de lymphocytes CD4+ infectés par le VIH-1 est de 1 pour 100 à 1 pour 100 000 et, chez les patients en sida, il est de plus de 10 pour 100. Cette technique nécessitant l'isolement de l'ADN, les résultats de l'amplification ne peuvent être associés à un type spécifique de cellules. La PCR identifie les cellules infectées, qu'elles le soient sous forme latente ou réplicative.

Le mérite de ce travail est d'associer la PCR et l'hybridation in situ, ce qui nécessite d'effectuer les contrôles spécifiques de ces deux techniques. Les auteurs ont étudié plusieurs lignées cellulaires infectées de manière latente ou non infectées (U1/U937, ACH2/CEM, SupT-1/H9) en mélangeant chaque couple de cellules à des dilutions diverses. Le ratio des cellules infectées et non infectées en PCR in situ était celui attendu par calcul théorique. Leurs expériences ont démontré que l'amplification in situ peut être accomplie dans des populations cellulaires ayant intégré une ou deux copies du provirus VIH-1, l'ADN amplifié ne contamine pas les cellules non infectées, enfin la PCR in situ est beaucoup plus sensible que les méthodes de PCR standard. Bagasra et coll. n'expliquent pas cette plus grande sensibilité. Il apparaît cependant qu'avec la PCR standard, l'ADN du VIH est dilué dans de l'ADN ne contenant pas de VIH, ce qui peut diminuer la sensibilité de la méthode. Dans une cellule, un segment d'ADN peut être amplifié de manière concentrée, sans être dilué par un autre ADN. Cette plus grande sensibilité de la PCR in situ (elle est multipliée par 10) n'affecte pas sa spécificité. Les auteurs pensent que le risque de contamination des échantillons est fortement diminué puisque seules seront contaminées quelques cellules, alors qu'avec l'amplification de l'ADN classique, la totalité de l'ADN est contaminée.

La conséquence la plus importante de l'infection à VIH est la forte déplétion du nombre de lymphocytes CD4+. Plusieurs théories ont été proposées pour expliquer ce phénomène (1). Ce travail apporte quelques précisions, en montrant qu'un grand nombre de cellules mononucléées du sang périphérique contiennent le provirus. Ceci suggère que les effets cytopathiques directs peuvent être une cause importante de la diminution des lymphocytes CD4+, mais pas nécessairement la seule. De plus, l'hypothèse selon laquelle le VIH n'est pas l'agent étiologique primaire du sida est maintenant, pour les auteurs, très contestable.

Malgré la difficulté de mise en œuvre de la PCR in situ, cette technique est intéressante pour déterminer la charge provirale, celle-ci étant en relation directe avec le stade clinique de l'infection à VIH. La quantification de cette charge peut donc être un des éléments critiques dans l'appréciation du pronostic d'évolution de l'infection et de l'efficacité d'une thérapeutique.

Etant donné la plus grande sensibilité, sans perte de spécificité, de la PCR in situ, cette technique pourrait être utilisée, dans des laboratoires spécialisés, pour déterminer les enfants qui, nés de mères séropositives, sont contaminés par le VIH-1 (en association avec l'Ag p24, l'étude des anticorps anti-VIH en western-blot, la culture virale…).

- Christine Defer, Michèle Maniez

1 - Fauci A.S.

«The human immunodeficiency virus : infectivity and mechanisms of pathogenesis»

Science, 1988, 617-622