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n°118 - septembre/novembre

 


Le point sur les mesures immunologiques

 

Laurence Weiss

Hôpital européen Georges Pompidou (Paris)

Pierre-Marie Girard

Service des maladies infectieuses, Hôtal Saint-Antoine (Paris)








"Access for all": le slogan doit-il valoir aussi pour les tests immunologiques - et à quel prix ? A l'heure où le coût des examens de laboratoire en vient à dépasser celui de certains traitements antirétroviraux dans les pays à ressources limitées, la conférence de Bangkok était l'occasion de faire le point sur les multiples pistes de numération des CD4 à moindre coût.

 

L’OMS recommande de débuter les antirétroviraux chez les patients infectés par le VIH symptomatiques, mais également chez des sujets asymptomatiques dont le chiffre de lymphocytes CD4 circulants est inférieur à 200/mm3. Lorsqu’il est impossible d’avoir accès à une numération des lymphocytes CD4, le traitement est recommandé pour les personnes symptomatiques dont le chiffre des lymphocytes totaux est inférieur à 1200/mm3. Il n’y a pas actuellement de réelle recommandation concernant les personnes asymptomatiques qui n’ont pas accès à une numération des lymphocytes T CD4.
La mesure de lymphocytes CD4 est par ailleurs indispensable selon les "bonnes pratiques" des pays industrialisés pour poser l’indication des prophylaxies primaires et évaluer la réponse immunologique au traitement antirétroviral.
Un accès restreint à la numération des lymphocytes T CD4 pourrait compromettre un accès élargi aux antirétroviraux pour les patients asymptomatiques.
Actuellement, de nombreuses équipes de cliniciens et de chercheurs et des industriels évaluent ou développent des équipements ou des techniques, capables de mesurer les lymphocytes T CD4 à moindre coût dans les pays à ressources limitées.
Par ailleurs, bien que des communications soulignent régulièrement l’intérêt des chiffres de lymphocytes totaux comme marqueur de substitution des chiffres de lymphocytes T CD4, ceci est très controversé (voir Transcriptases n°109). Il a d’ailleurs été souligné à Bangkok par une équipe indienne1 qu’utiliser le taux des lymphocytes totaux comme marqueur de substitution des chiffres de lymphocytes CD4 chez des enfants infectés par le VIH avait pour résultat une classification erronée dans différentes strates de chiffres de lymphocytes CD4, notamment dans la strate à moins de 200 cellules/mm3. La numération lymphocytaire pourrait être utilisée comme test de "screening" afin de cibler les sujets qui devraient bénéficier d’une mesure des lymphocytes T CD4. Toutefois, ceci ne peut être généralisé à l’ensemble du globe car il est possible que l’expansion de certaines populations cellulaires (comme les cellules NK) rende cette approche erronée dans certaines régions.

Quelles sont les méthodologies disponibles en 2004 pour mesurer les chiffres de lymphocytes CD4 circulants ?

La technique "gold standard" de référence est la cytométrie de flux en trois ou quatre couleurs. Compte tenu du coût de l’équipement et de celui de la maintenance, cette méthodologie ne peut qu’être réservée à des laboratoires centralisés dits "de référence" qui assurent la mesure des lymphocytes CD4 sur un nombre important d’échantillons. Le coût d’une numération des lymphocytes CD4 par cette technologie de référence est en effet actuellement de l’ordre de 20 dollars par test.
- L’équipe de Janossy2,3 a publié, depuis plusieurs années maintenant, sur l’intérêt d’une méthodologie nommée "Pan LeuKogating" qui permet, par une technique cytométrique à deux couleurs dont un marqueur pan-leucocytaire (CD45/CD4), d’obtenir des résultats tout à fait fiables de pourcentage et de chiffres de lymphocytes CD4 ; et ce à un moindre coût, qui peut être actuellement inférieur à 6 dollars par test, et qui pourrait peut-être encore diminuer grâce à l’utilisation d’anticorps monoclonaux génériques. Néanmoins, cette technique n’a d’intérêt réel que pour des laboratoires déjà équipés d’un cytofluoromètre.
- D’autres équipements utilisant la cytométrie de flux ont été développés ces deux/trois dernières années. Le Cyflow® (PARTEC) a déjà été implanté dans un nombre important de sites dans les pays du Sud et notamment en Afrique et au Cambodge, alors même que peu de résultats avaient été communiqués concernant la corrélation entre les chiffres de CD4 obtenus par le Cyflow® et ceux obtenus avec la technique de référence.
Des résultats ont été présentés à Bangkok par des équipes de Médecins sans frontières4 sur leur expérience au Malawi montrant une bonne corrélation entre les résultats obtenus par le Cyflow® et le FACSCount sur 311 échantillons de sang. Les Thaïlandais5 ont également rapporté leur expérience du Cyflow®. Les résultats obtenus ont été comparés avec ceux obtenus par deux méthodes de référence utilisant le FACScalibur (TruCount®) et le FACSCount. Les deux techniques utilisées sont des techniques sans lyse du sang. Ils ont observé une bonne corrélation, avec toutefois des différences plus importantes dans le système TRUCount® que dans le système FACSCount®. D’autres résultats, qui n’ont pas été présentés lors de cette Conférence, suggèrent que la corrélation entre la technique Cyflow® et la technique de référence dépend de l’utilisation ou non de réactifs de lyse dans cette dernière. De plus, cette technique n’utilise qu’un seul anticorps monoclonal (anticorps anti-CD4) ; on connaît mal l’impact des monocytes qui expriment faiblement la molécule CD4 sur les chiffres de lymphocytes TCD4 obtenus par cette technique. Cette question est actuellement abordée dans une étude au Ghana chez des patients coinfectés (VIH + tuberculose). Le Cyflow® est un appareil séduisant dont le coût est d’environ 15 à 20000 euros pour l’équipement, et de 3-5 dollars le test. Néanmoins il nous manque actuellement des données précises de corrélation dans des strates de CD4 pertinentes pour la prise en charge clinique (par exemple 150-350), et nous n’avons encore que peu d’informations sur l’utilisation à moyen terme de cet appareil et les supports techniques fournis par PARTEC dans les différents sites.
- L’appareil développé par "GUAVA Technologies" est un cytomètre miniaturisé qui permet l’utilisation d’une quantité moindre de réactifs (Guava Easy CD4 system®) avec un coût du test moindre, de l’ordre de 4 dollars. Des études de corrélation dans différents sites d’Amérique du Nord et une étude préliminaire sur un nombre limité d’échantillons réalisée à Chennai (Inde) ont été présentées cette année à la CROI et à Bangkok. La corrélation semble excellente mais doit encore être validée sur le terrain. Toutefois, le coût de l’appareil est notable (35 à 40000 dollars). De plus, peu de renseignements sont disponibles sur l’utilisation de cet équipement au quotidien, sa maintenance et le support technique.
Il est clair que compte tenu du coût de cet équipement, il ne pourrait être réservé qu’à des laboratoires dits "de référence" qui traiteront un volume important d’échantillons par jour.
- L’équipement développé par "POINT CARE technologies" est un cytomètre à micro laser utilisant des anticorps conjugués à des particules d’or colloïdal. A notre connaissance, une seule étude de corrélation est à ce jour disponible et a été présentée par Susanne Crowe (Burnett Insitute, Melbourne) au symposium satellite organisé par le "Forum for collaborative HIV Research". La corrélation était excellente. Néanmoins, l’évaluation de cet équipement apparaît tout à fait préliminaire. Le coût actuel du test est évalué à environ 10 dollars. Il paraît important de disposer de l’évaluation de ces équipements sur le terrain.
- Un équipement séduisant, qui n’utilise pas la cytométrie de flux, est celui commercialisé par Lab Now. Il s’agit d’un petit dispositif "microchip" qui permettrait de mesurer directement les lymphocytes CD4 à partir d’une goutte de sang. Les réactifs sont à l’intérieur d’une cartouche de la taille d’une carte de crédit, qui permet de marquer les CD4 avec des anticorps fluorescents. Une diode émettant de la lumière est utilisée à la place d’un laser. Cette technique a été développée par des chercheurs de l’Université de Texas. Le coût de l’appareillage serait d’environ 1000 dollars, avec actuellement un coût du test entre 3 et 5 dollars. Cette technique est intéressante compte tenu du faible coût de l’équipement. Toutefois, on ne dispose actuellement que de peu voire pas de réelle étude de corrélation des résultats obtenus par cette technique comparés aux techniques dites de référence. Cet équipement devrait être disponible pour des évaluations prochainement.

Des avancées sur les techniques manuelles de numération des lymphocytes T CD4 ?
Deux techniques ont principalement été évaluées notamment sur le terrain. La technique Dynabeads® (Dynal) dont l’évaluation6 a récemment été commentée dans Transcriptases (n°114). Cette technique donne des résultats extrêmement bien corrélés à ceux obtenus en cytométrie de flux par la technique de référence TRUCount®. Il ne nécessite pas d’appareillage coûteux si ce n’est un microscope à fluorescence, qui d’ailleurs peut servir à d’autres explorations faites dans des laboratoires polyvalents. La difficulté à laquelle nous nous sommes heurtés pour l’implantation de cette méthode manuelle dans les laboratoires des pays du Sud est que cette technique est considérée comme fastidieuse pour les techniciens, car il s’agit de compter au microscope des lymphocytes CD4 isolés grâce à un système de billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD4. Il semble qu’actuellement cette technique ne soit réellement implantée de façon large qu’au Togo. Une équipe japonaise7 a présenté les résultats obtenus par la technique Dynabeads® utilisant une moindre quantité de billes magnétiques recouvertes d’anticorps, afin d’en diminuer le coût et surtout de permettre une lecture en microscopie optique à la place du microscope à fluorescence. Bien entendu, cette étude a été réalisée avec succès au Japon, puisque l’utilisation d’un microscope optique permet un compte tout à fait fiable des lymphocytes CD4. Toutefois, il ne semble pas réaliste de tenter d’implanter cette technique dans des laboratoires du Sud qui sont déjà réticents à l’utilisation de cette même technique avec une lecture plus facile en microscopie à fluorescence.
La technique Cytosphères® (Coulter)8 permet d’isoler les lymphocytes CD4 "ayant fait rosettes" grâce à l’utilisation de billes de latex recouvertes d’anticorps monoclonal anti-CD4. Elle n’a pas fait l’objet de nouvelles communications à Bangkok. L’évaluation de cette technique sur le terrain à Chennai a été récemment publiée9. Néanmoins, la difficulté de lecture est le principal facteur bloquant pour l’utilisation de cette technique. Des appareils permettant une lecture automatisée devaient être développés... Par ailleurs, le coût du test est actuellement plus élevé que celui du test Dynabeads (10 5 dollaversusrs).

Les stabilisateurs de sang
Plusieurs stabilisateurs de sang peuvent être utilisés pour différer la réalisation d’une technique de cytofluorométrie de numération CD4. Ces stabilisateurs ne peuvent pour l’instant pas être utilisés pour les techniques manuelles, car ils n’ont pas fait leur preuve dans ces conditions de mesure.
Les stabilisateurs disponibles ou qui devraient l’être prochainement sont le Cyto ChexTM (Streck Laboratories) et ceux développés par le NEQAS (au Royaume-Uni). Le premier, qui permet une stabilisation du sang pendant plus de 300 jours, pourrait être utilisé pour l’assurance qualité. Le second, le TransfixTM10, grâce à une conservation de l’échantillon sanguin pendant au moins 10jours à une température inférieure à 25°C, permet d’envoyer des échantillons sanguins à un laboratoire de référence pour un contrôle de qualité, voire de mesurer les lymphocytes CD4 en cytométrie pour des échantillons prélevés à distance et transportés vers le laboratoire de référence.

Quelles techniques de numération CD4 conseiller en juillet 2004 pour la numération des CD4 dans les pays à ressources limitées ?

Le choix de la méthodologie doit dépendre du nombre d’échantillons sanguins traités chaque jour et donc de la taille de la file active suivie, ainsi que du degré de sophistication du laboratoire. De nouvelles technologies émergent mais n’ont été pour l’instant que très peu évaluées sur le terrain, à la fois en termes de corrélation par rapport à la technique de référence, et en termes de facilité d’utilisation et de support technique/maintenance sur le moyen/long terme. Les coûts des équipements proposés sont extrêmement divers, allant de 1000 à 40000 dollars. Des informations sur le support technique fourni par les industriels pour les différents équipements sont absolument indispensables. Celles-ci peuvent d’ailleurs déjà être en partie recueillies pour le Cyflow® auprès des équipes utilisant cet équipement.
La décision d’utiliser tel ou tel équipement ou telle ou telle technique dépend donc du site (capitale, laboratoire de province ou en zone plutôt rurale), du type du laboratoire (centralisé ou non, présence de techniciens supérieurs), du nombre d’échantillons techniqués chaque jour, et enfin du coût de l’équipement et des réactifs, coûts qui probablement vont évoluer à la baisse. Les laboratoires de référence pourraient être équipés d’un appareil de cytomètrie de flux et devraient participer à des contrôles de qualité externes internationaux.
Des études "coût-efficacité" permettraient de définir plus précisément la méthodologie la plus appropriée, en fonction du type de laboratoire et du volume d’échantillons techniqués et/ou de la file active de patients suivis. Il nous apparaît par exemple que, malgré la réticence des biologistes des pays du Sud, la technique Dynabeads® pourrait être tout à fait adaptée pour des laboratoires même peu sophistiqués et assurant le suivi d’un nombre limité de patients.
L’évaluation de ces techniques ou équipements devrait être réalisée sur le terrain dans des études indépendantes des industriels. Dans tous les cas, quelles que soient les techniques utilisées, des contrôles de qualité devront être organisés au niveau national.

L’implantation d’une ou plusieurs techniques de numération des CD4 est elle un pré-requis incontournable à l’introduction des antirétroviraux ?

Cette question cruciale demeure sans réponse claire à ce jour. Pire, il nous semble que le débat n’a été ouvert que très récemment : il a fallu attendre 2003 pour que des instances telles que l’OMS et l’Onusida inscrivent enfin dans leurs recommandations l’indication des antirétroviraux sur des critères cliniques associés à une simple lymphopénie totale. La mise au point faite ici illustre les efforts importants de simplification et de réduction des coûts des tests, démarche certes louable mais exprimant implicitement la conviction de la majorité des équipes que la numération des lymphocytes CD4 est la pierre angulaire biologique de la thérapeutique antirétrovirale. L’enjeu est majeur. Les éléments du débat sont multiples et ne sont certainement pas spécifiques à la technique de numération des CD4. Il s’agit en fait de s’interroger sur la validité des dogmes et paradigmes fondateurs de la thérapeutique antirétrovirale dans les pays du Nord pour les patients des pays à ressources limitées. Force est de constater que l’essentiel des recommandations proposées pour les pays du Sud ne constitue qu’une extrapolation, voire une exportation de concepts validés dans les pays du Nord, concepts qu’il conviendrait de sérieusement revisiter à la lumière des données de suivi de cohortes à long terme, et des progrès dans le domaine des molécules antirétrovirales. Gardons en effet en mémoire l’abandon récent de la mesure de la charge virale plasmatique en tant que critère biologique principal de l’indication des antirétroviraux au profit de la numération des CD4.
Revenons à l’intérêt de la numération des lymphocytes CD4. Lorsqu’il s’agit de décider de débuter un traitement antirétroviral chez un patient atteint de sida (selon la définition clinique proposée pour les régions tropicales), le nombre de lymphocytes CD4 n’est pas absolument nécessaire. Les patients ayant des critères cliniques de sida devraient être prioritaires pour obtenir des antirétroviraux, car ils sont en danger de mort à court terme, et les traitements antirétroviraux ont fait la preuve de leur efficacité sur la réduction de la mortalité dans cette situation. N’envisager une politique d’accès aux antirétroviraux qu’après avoir implanté une technique de mesure des CD4 (choisir la technique, négocier les prix, mettre à niveau les laboratoires, former le personnel, organiser la continuité des approvisionnements en réactifs et la maintenance des équipements) ne pourrait faire que retarder l’initiation des traitements. L’urgence est de traiter les patients symptomatiques atteints de sida.
Ainsi, en première approche, dans les régions à forte prévalence où l’accès aux traitements antirétroviraux est encore limité, l’indication du traitement antirétroviral pourrait être définie sans la numération des lymphocytes CD4. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique peut être faite sur les marqueurs cliniques chez les patients symptomatiques : la reprise du poids est un excellent marqueur de l’efficacité du traitement.
C’est en fait à moyen et long terme que la surveillance de la numération des CD4 revêt toute son importance. Mais pas à n’importe quel prix ! La réduction des coûts des traitements est telle que les coûts des examens de laboratoire excèdent ceux des médicaments antirétroviraux. Ceci souligne l’importance d’évaluer et d’implanter des techniques fiables, à moindre coût, de numération des lymphocytes CD4, de façon à pouvoir dans un second temps initier des traitements chez des sujets asymptomatiques et suivre l’efficacité immunologique des traitements ARV. Dans tous les cas, il conviendrait de définir des critères de réponse au traitement adaptés au suivi des patients dans les pays à ressources limitées.
Dans un programme global de prise en charge des personnes infectées par le VIH, l’accès à la numération des CD4 apparaît importante sinon incontournable. Chaque pays devrait disposer d’au moins un laboratoire centralisé de référence capable d’énumérer de façon fiable les lymphocytes T CD4 circulants.
Il conviendrait peut-être de réfléchir à des modalités radicalement différentes de thérapeutique antirétrovirale, notamment dans les pays à forte prévalence où la situation épidémiologique justifierait des traitements de masse : les marqueurs d’efficacité des traitements pourraient n’être utilisés qu’au sein d’un sous-groupe "sentinelle" de patients. Le trépied thérapeutique serait alors: diagnostic de l’infection VIH (test rapides) - antirétroviraux (schémas simples) - aide à l’observance.



1 - Kanthimathinathan H.K., Swaminathan S., Subramaniyam S. et al.,
"Is Total Lymphocyte count a good predictor of CD4 count in HIV infected children ?",
TuPeB4447

2 - Janossy G., Jani I., Gohde W.,
"Affordable CD4(+) T-cell counts on "single-platform" flow cytometers I. Primary CD4 gating",
Br J Haematol, 2000,111, 1198-1208.

3 - Glencross D., Scott L.E., Jani I., Barnett D., Janossy G., «
"CD45-assisted PanLeucogating for accurate, cost-effective dual-platform CD4+ T-cell enumeration",
Cytometry, 2002, 50, 69-77

4 - Fryland M., Chaillet P., Bonte L. et al., «
"The PARTEC CyFlow counter for CD4+ T-cell counting produces high quality results and is robust when evaluated under routine field conditions in Malawi",
TuOrB1149

5 - Pattanapanyasat K., Noulsri E., Lerdwana S. et al.,
"Evaluation of a new single-platform volumetric flow cytometer for enumeration of absolute CD4 T-lymphocyte counts in HIV-1 infected Thai patients",
MoPeB3176

6 - Diagbouga S., Chazallon C., Kazatchkine M.D. et al., «
"Successful implementation of a low-cost method for enumerating CD4+ T lymphocytes in resource-limited settings : the ANRS 12-26 study",
Aids, 2003, 17, 2201-2208

7 - Bi X., Gatanaga H., Tanaka M. et al., «
"Modifications of dynabeads method for enumerating CD4+ T cell count in resource-limited situations",
TuPpB2038

8 - Landay A., Ho J.L., Hom D. et al., «
"A rapid manual method for CD4+ T-cell quantitation for use in developing countries",
Aids, 1993, 7, 1565-1568

9 - Balakrishnan P., Dunne M., Kumarasamy N. et al., «
"An Inexpensive, Simple, and Manual Method of CD4 T-Cell Quantitation in HIV-Infected Individuals for Use in Developing Countries",
JAIDS, 2004, 36, 1006-1010

10 - Jani V., Janossy G., Iqbal A. et al., «
"Affordable CD4+ T cell counts by flow cytometry. II. The use of fixed whole blood in resource-poor settings",
J Immunol Method, 2001, 257, 145-154