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n°71 - Janvier - Février 1999


Resistances aux antirétroviraux : Les méthodes virologiques d'analyse de la sensibilité des souches virales

Laurent Bélec
Laboratoire de virologie et Inserm U430 - Hôpital Broussais (Paris)
Ali Si Mohamed
Laboratoire de virologie, Hôpital Broussais (Paris)








Les méthodes virologiques permettant de déterminer le degré de sensibilité ou de résistance des souches virales vis-à-vis d'une molécule antirétrovirale sont relativement complexes. Elles nécessitent des laboratoires spécialisés. Aussi restent-elles, le plus souvent, réservées au domaine de la recherche. La compréhension des mécanismes impliqués dans la sélection des mutants résistants est pourtant indispensable pour rationaliser le traitement antirétroviral.

Les souches virales peuvent être caractérisées par leur phénotype (dynamique de la culture en présence de concentrations croissantes d'antiviral) et leur génotype de sensibilité (répertoire des codons sauvages et mutés dans le gène codant pour la protéine cible de l'antiviral) vis-à-vis d'une molécule antirétrovirale, voire de plusieurs en cas d'association thérapeutique. Les déterminations du phénotype de sensibilité et du génotype de sensibilité sont souvent complémentaires. En effet, la mise en évidence de mutations de résistance par des techniques de biologie moléculaire ne suffit pas toujours à affirmer que la souche étudiée présente in vivo une perte de sensibilité, du fait de l'existence possible d'interactions moléculaires entre les mutations de résistance entre elles, et entre les mutations de résistance et d'autres mutations dites compensatrices, situées sur d'autres gènes. Par ailleurs, il existe un certain polymorphisme naturel du gène de la protéase.

Phénotype de sensibilité.

Le phénotype de sensibilité du VIH à un antiviral est évalué par la détermination des concentrations inhibitrices (CI) qui réduisent in vitro le niveau de réplication d'un inoculum viral bien défini, exposé à des concentrations croissantes d'antiviral, par rapport à celui d'une population virale non traitée. Les concentrations inhibitrices habituellement mesurées sont la CI50 et la CI90, généralement exprimées en µM: CI50 (ou concentration d'antiviral nécessaire pour inhiber in vitro la réplication virale de 50%) et CI90 (concentration d'antiviral nécessaire pour inhiber in vitro la réplication virale de 90%). Les CI50 et CI90 peuvent varier dans des proportions importantes pour une même molécule et pour un même isolat viral, en fonction du test utilisé pour quantifier la réplication virale. Les CI50 et CI90 doivent donc être interprétées par rapport à un système cellulaire et pour un test donnés. D'une façon générale, plus les CI50 et CI90 sont élevées, moins la souche virale est sensible à la molécule testée. L'Agence Nationale de Recherches sur le Sida (ANRS) a validé une technique classique, consensuelle et standardisée, pour la détermination du phénotype de sensibilité. Un isolat de VIH (surnageant de culture virale pris au pic d'activité transcriptase inverse, soit environ 100 TCID50) est cultivé sur une microplaque de 96 puits avec des lymphocytes de donneurs sains, préalablement activés par la phytohémagglutinine, en présence de concentrations croissantes d'antiviral; dix jours après l'inoculation, la réplication virale est évaluée par la mesure de l'activité transcriptase inverse dans le surnageant de chaque puits; les charges virales au 10e jour sont estimées pour chaque concentration d'antiviral. Les CI50 et CI90 sont alors calculées par intrapolation à partir de la courbe d'inhibition de la réplication du VIH en fonction de la concentration de drogue testée. Ce test nécessite l'isolement du virus, puis sa culture à plusieurs dilutions en présence de concentrations croissantes d'antiviral; il est long (1 mois), coûteux, difficile, et peu adapté à des décisions thérapeutiques en pratique médicale.

Depuis trois ans, une nouvelle génération de tests phénotypiques a été développée, et récemment améliorée. Ainsi, la technique RVA pour " Recombinant Virus Assay " consiste à réaliser directement l'amplification du gène d'intérêt (transcriptase inverse ou protéase virale) par rétrotranscription inverse suivie de polymérisation par amplification en chaîne (PCR nichée), à partir du plasma (virus réplicatif). Cette technique est plus simple que la précédente, parce qu'elle ne nécessite pas d'isolement viral. Ces produits de PCR sont ensuite cotransfectés dans des cellules eucaryotes, en association avec un plasmide renfermant l'ADN complémentaire complet du VIH, mais délété du gène d'intérêt. Dans ces cellules, le produit de PCR transfecté et le plasmide se recombinent génétiquement pour former un ADN complémentaire complet du VIH, renfermant le gène codant pour la cible des antirétroviraux par rapport auxquels la sensibilité du VIH recombinant sera évaluée. Il devient alors possible de recueillir cette population virale dans le surnageant de culture. Un test phénotypique est ensuite réalisé en utilisant des lignées de lymphocytes T, comme des cellules Sup T1, en mesurant la production virale en présence de concentrations croissantes d'antirétroviraux, grâce à la détection de l'activité transcriptase inverse dans les surnageant de culture. Des améliorations récentes (groupe de virologie médicale de l'ANRS sous la direction de J.-M. Huraux) permettent de réaliser des tests de type RVA avec une bonne reproductibilité (meilleure standardisation que les techniques phénotypiques classiques) et une meilleure accessibilité, sans qu'ils puissent encore être considérés comme des tests de routine.

Génotype de sensibilité.

De nombreuses techniques permettent de déterminer le génotype de résistance; les plus utilisées sont le séquençage, la PCR sélective, la RFLP, et le LiPA.

La recherche des mutations génomiques conférant la résistance à un antirétroviral est possible par séquençage partiel ou complet du gène codant pour la cible de la molécule antivirale, soit après clonage, soit directement à partir des produits de PCR. Ces techniques sont utilisées pour identifier des mutations encore inconnues au sein d'isolats viraux exprimant un phénotype résistant. La simplification des techniques de séquençage (démocratisation de l'accès aux séquenceurs automatiques), voire le développement de systèmes de séquençage plus particulièrement adaptés au VIH et permettant l'analyse rapide des génotypes obtenus (DNA chips™; OpenGene™) pourraient permettre à terme une plus grande utilisation du génotype de sensibilité.

Lorsque les mutations de résistances sont déjà bien identifiées, il est possible de les rechercher par des techniques de biologie moléculaire. La technique la plus utilisée est une PCR " nichée " (le produit de première amplification sert de cible à une seconde amplification à l'intérieur de celui-ci) dite " sélective ", parce que des dilutions successives du produit de première PCR sont réamplifiées en utilisant des amorces correspondant aux codons sauvages et d'autres aux codons mutés, et " différentielle ", parce que l'interprétation est en partie basée sur la comparaison des signaux obtenus avec les amorces des codons sauvages et celles des codons mutés. Cette technique est bien standardisée pour la recherche des mutations à l'AZT (pol 215 et pol 41 notamment), à la ddI (pol 74), et à la ddC (pol 74). La recherche de mutations de résistance par PCR nichée différentielle en dilution limite est une technique relativement sophistiquée, qui nécessite environ 3 à 4 jours de manipulation.

La technique Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) consiste à réaliser l'amplification d'une partie du génome viral codant pour la cible de l'antiviral utilisé, et à traiter l'amplicon correspondant par des enzymes de restriction judicieusement choisies pour couper l'ADN de façon différente en l'absence et en présence d'une mutation de résistance; le profil de migration sur gel d'agarose des amplicons ainsi digérés permet de déterminer si la souche virale est majoritairement sensible, ou mutée. Cette technique peut être utilisée pour détecter la résistance à la lamivudine (3TC) sur le codon pol 184 du gène de la transcriptase inverse.

La détection des principales mutations liées à la résistance aux analogues nucléosidiques est réalisable par la technique Line Probe Assay (LiPA). Après une première étape d'extraction de l'ARN viral, celui-ci est rétrotranscrit en ADN complémentaire; ensuite, une partie du gène de la transcriptase inverse est amplifiée par amplification nichée; enfin, les amplicons sont hybridés avec des sondes biotinylées spécifiques de chacune des mutations recherchées, déposées sur une bandelette (support solide); les bandes d’hybridation sont révélées par un système streptavidine-phosphatase alcaline, en utilisant du NBT et BCIP comme substrats. La trousse HIV RT LiPA d'Innogenetics® permet la détection des mutations des codons 41, 69-70, 74, 184 et 215 du gène de la transcriptase inverse.

Les recherches de mutations conférant la résistance à une molécule par PCR sélective, RFLP et LiPA sont essentiellement qualitatives ; elles permettent d'évaluer si la majorité de la population virale est mutée, sauvage ou mixte (mutée et sauvage). Des techniques quantitatives sont en cours de développement. En général, ces recherches génotypiques se font à partir de plasma, plutôt qu'à partir des cellules mononucléées circulantes. En effet, le virus plasmatique reflète le réservoir rapidement réplicatif, le plus propice à voir émerger un variant sous l'action de la pression médicamenteuse. La détection des mutations de résistance dans le plasma est plus sensible que leur recherche dans le réservoir des cellules mononucléées.

En pratique médicale, la recherche de certaines mutations de résistance peut être intéressante. Par exemple, la principale mutation conférant la résistance à l'AZT, en pol 215, peut être détectée dans le but d'adapter le traitement antirétroviral en cas de génotype muté, en remplaçant l'AZT par une autre molécule antirétrovirale. La mutation en pol 215 est bien corrélée à un phénotype de résistance in vitro ; elle possède de plus une bonne valeur prédictive d'évolution péjorative. Des études récentes ont montré que plus de 15% des souches de primo-infection étaient résistantes à l'AZT. Ces observations posent le problème de la bithérapie systématique lors du traitement des primo-infections ou lors de la chimioprophylaxie des accidents professionnels par piqûre; de façon plus générale, elles soulignent aussi l'intérêt de documenter le génotype de résistance à l'AZT avant d'utiliser cette molécule. Ces considérations pourraient être étendues aux autres molécules antirétrovirales.

La description régulière de nouvelles mutations de résistance, les difficultés d'établir la responsabilité de la résistance dans l'inefficacité thérapeutique ou dans la progression clinique, la multiplication des associations thérapeutiques et les phénomènes d'interactions entre les mutations conférant la résistance ont longtemps restreint, en pratique, la nécessité de déterminer la sensibilité des souches dans la plupart des stratégies thérapeutiques actuellement recommandées. Cependant, l'évolution et la simplification des techniques d'analyse des résistances laissent penser que la recherche de résistances sera plus aisée dans un proche avenir. Les indications de la détermination du génotype élargi au gène de la transcriptase inverse ou de la protéase ne sont pas encore posées; de tels génotypes pourraient être utiles en recherche clinique, avant mise sous traitement antirétroviral et en cas d'échec thérapeutique. - Laurent Bélec, Ali Si Mohamed

Méthodes virologiques d'analyse de la sensibilité du VIH

Phénotype de sensibilité

Définition :

Pouvoir réplicatif d'un isolat de VIH dans un système de culture in vitro en présence d'une molécule antivirale.

Principales techniques :

- Inhibition de l'activité transcriptase inverse en culture lymphocytaire du VIH, en présence de concentrations croissantes de l'antiviral testé: technique longue et difficile (technique de référence pour la recherche);

- " RVA ", ne nécessitant pas d'isolement viral: technique plus facile et mieux standardisée.

Génotype de sensibilité

Définition :

Répertoire des mutations conférant la résistance sur le gène codant pour la cible de la molécule antivirale.

Principales techniques :

a. Séquençage

- après clonage : technique longue et difficile (recherche);

- direct des produits de PCR du gène d'intérêt (applicable en routine grâce à la simplification des techniques de séquençage automatique).

b. PCR sélective :

- par des amorces correspondant soit aux codons sauvages, soit aux codons mutés;

- standardisée pour les mutations à l'AZT, la ddI et la ddC.

c. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) :

- standardisée pour la mutation pol 184 au 3TC.

d. Line Probe Assay (LiPA) :

- Hybridation des produits de PCR sur une membrane portant des sondes spécifiques de certaines mutations ;

- détection des mutations des codons pol 41, pol 69-70, pol 74, pol 184 et pol 215 (n'identifie que les mutations proposées par le test).