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n°114 - février/mars 04

 


VIH - CD4

Nouvelles méthodes de mesure des CD4, une alternative à moindre coût pour l'Afrique ?

 

Patrice Debré

Laboratoire d'immunologie cellulaire, Hôpital Pitié-Salpêtrière (Paris)

 




Use of Dried whole blood spots to measure CD4+ lymphocyte counts in HIV-1 infecteed patients
Mwaba P., Cassol S., Pilon R., Chintu C., Janes M., Nunn A., Zumia A.
The Lancet, 2003, 362(9394), 1459-60

Successful implementation of a low-cost method for enumerating CD4+ T lymphocytes in resource-limited settings : the ANRS 12-26 study
Diagbouga S., Chazallon C., Kazatchkine M. D., Van de Perre P., Inwoley A., M’Boup S., Prince David M., Thiéro Ténin A., Soudré R., Aboulker J.P., Weiss L
AIDS, 2003, 17, 2201-08

Deux études proposent des méthodes de numération des lymphocytes CD4 alternatives à la cytométrie de flux. Caractérisées par leur facilité d'utilisation et leur moindre coût, ces techniques pourraient répondre aux difficultés rencontrées pour la mesure des CD4 dans les pays en développement.

 

Le premier article, signé par Serge Diagbouga et coll. dans la revue AIDS, rapporte la faisabilité et l'intérêt de l'utilisation d'une technique alternative à la cytométrie de flux : la quantification des lymphocytes CD4 par microscopie à fluorescence, après leur isolement par billes couplées à des anticorps anti-CD4. L'étude est menée en Afrique de l'Ouest et inclut 35 patients séropositifs, recrutés à Abidjan, Bamako, Bobo-Dioulasso, Dakar, Lomé, et Ouagadougou. Six laboratoires et 43 techniciens pas ou faiblement expérimentés en techniques immunologiques ont participé à cette étude, dont le centre de référence est le centre Muraz à Bobo-Dioulasso. Les techniciens des laboratoires participants ont été formés pendant deux jours par le principal investigateur et par un technicien du site de référence.
La technique d'isolement par billes est effectuée par leur incubation dans un échantillon de sang prélevé sur EDTA. Les billes sont ensuite séparées par concentrateur de particules magnétiques. Les lymphocytes sont marqués par acridine orange et comptés sur cellules de Mallassez. Cette technique est comparée aux méthodes de cytométrie de flux selon les mesures usuelles effectuées par un cytomètre de flux FACSCAN.

Les mesures effectuées sur 657 échantillons permettent l'étude de corrélations entre les deux techniques, et plus précisément l'étude de leurs différences pour les différents taux de lymphocytes (en dessous de 200/mm3, entre 200 et 350/mm3, entre 350 et 500/mm3, entre 500 et 1000/mm3). Parmi les 74 cas discordants, seuls 31 (4,5%) ont une différence de plus de 100/mm3. Le coefficient de corrélation entre les résultats des deux techniques est ainsi de 0,89. L'examen de ces résultats montre donc que les deux techniques sont très largement corrélées. La facilité de cette méthode alternative permet ainsi qu'elle soit largement comparée avec la cytométrie de flux, et qu'elle soit recommandée, notamment dans le contexte de l'Afrique de l'Ouest.

Le second article, signé par Peter Mwada dans la revue Lancet, compare la cytométrie de flux à une technique alternative de mesure des CD4 sur des échantillons de sang séchés sur papier filtre. Cette technologie, expérimentée en Zambie à partir de 42 patients infectés par le VIH, utilise des kits de mesure des CD4 par Elisa. Cette méthode utilise du sang fraîchement prélevé et déposé sur papier filtre (50 micro-litres par échantillon) et nécessite un laveur de micro-plaques ainsi qu'un lecteur. Ces papiers filtres, séchés à température de la pièce, peuvent être conservés pendant 30 jours avant d'être analysés par technique Elisa.

La moyenne des lymphocytes CD4 s'est révélée de 289 cellules par mm3 par cytométrie de flux, et de 347 cellules par mm3 pour le filtre par mesure Elisa. La différence entre ces deux méthodes augmente significativement quand le taux de CD4 est diminué à moins de 200 cellules par mm3. Pour des taux supérieurs à 200/mm3, une meilleure corrélation entre les deux méthodes est retrouvée. Ces résultats indiquent pour les auteurs que l'utilisation d'échantillons séchés sur papier filtre représente une potentielle alternative intéressante à la cytométrie de flux.

Un premier commentaire sur les méthodes présentées dans ces deux articles est qu'elles pourraient répondre aux difficultés particulières de la mesure du taux de CD4 dans les pays en développement. De fait, si certains laboratoires de référence disposent d'appareils pour cytométrie de flux, une majorité d'entre eux ne peut en avoir l'usage, notamment dans des consultations reculées, avec des conditions d'utilisation qui grèvent lourdement le suivi et le monitorage des patients séropositifs. Dans ce cadre, toute méthode alternative paraît judicieuse, et les deux exemples proposés sont certainement intéressants. On retiendra, dans un cas comme dans l'autre, que ces méthodes nécessitent un appareillage discret, peuvent être pratiquées par des techniciens sans formation spécialisée, et dans un laps de temps relativement limité ; la technique sur filtre peut être, de plus, différée. Le coût de revient, probablement faible, n'est pas signalé dans l'étude publiée par le Lancet, mais il est de 3 dollars par échantillon pour la première étude.

Deux critiques pourraient cependant être opposées à l'une et à l'autre des techniques. Dans le cas de la mesure par billes, le décompte sur cellules de Mallassez est une technique microscopique qui, par là-même, peut être considérée comme fastidieuse, nécessite du temps pour le technicien, et peut à la longue entraîner des biais de comptage, notamment après de longues séries. Dans le deuxième cas, Elisa sur filtre, cette technique nécessite d'être plus travaillée, notamment pour améliorer les conditions de mesure, et la stabilité des échantillons par recueil au doigt. Ce type d'expérimentation nécessite de plus d'être étudiée, pour obtenir les meilleures conditions de stockage (température, humidité et procédure d'extraction).

Quelles que soient les divergences de ces deux méthodes avec la cytométrie de flux pour les faibles valeurs de CD4, leur facilité d'emploi, leur faible coût de revient et leur application dans des conditions propres au monitorage des pathologies VIH en Afrique attire clairement l'attention. Si l'usage peut être recommandé lors des consultations courantes, il faut rappeler cependant que tout essai thérapeutique, et l'entrée de tout patient dans un protocole de recherche, nécessite auparavant une standardisation des techniques quelles que soient les méthodes préconisées, afin que celles-ci puissent être appliquées de manière homogène dans les différents centres de suivi des patients.
A notre sens, l'Afrique devrait bénéficier de telles méthodes dans le contexte qu'offre aujourd'hui ce continent : un grand nombre de patients séropositifs et une difficulté à pouvoir les suivre dans des centres de référence suffisamment équipés et soutenus par un budget conséquent.

Les points clés

Les mesures des CD4 en Afrique nécessitent la mise au point de techniques alternatives à faible coût et d'usage facile.

Deux nouvelles technologies, l'une par microscopie optique après séparation des cellules sur billes, l'autre par technique Elisa sur des échantillons de sang séchés sur papier filtre, permettent de mesurer des lymphocytes CD4 dans des régions d'endémie, en dehors des centres de référence.